HPLC 정성분석 방법 e.g. 녹차 속 카페인 정성분석

HPLC 정성분석 

 

HPLC 정성분석을 위해서는 여러가지 성분이 혼합된 시료가 준비되어야합니다. 준비된 시료는 HPLC로 분석하기 전에 기기의 오염을 최소화하기 위해 원심분리나 여과 등의 전처리과정을 거쳐야합니다. 전처리과정을 마친 시료는 기기에 주입하게 됩니다. 시료는 고정상에서 각각의 성분으로 분리되며 분리된 각 성분은 아래 그림에 나타난 것처럼 피크의 형태로 하나씩 검출됩니다. 이러한 피크의 집합형태를 ‘크로마토그램’이라고 부릅니다.

 

검출된 각 성분은 크로마토그램 형태로 수집되며 이러한 자료를 이용하여 데이터처리장치에서 정성 및 정량분석이 이루어집니다.

 

 

 

 

 

 

 

 

HPLC의 기본 구조 및 분석절차

 

위의그림은 HPLC의 기본구조를 나타냅니다. 크게 이동상용액, 펌프, 시료주입구, 고정상, 검출기 등으로 구성되어 있습니다. 몇가지 종류의 액체로 구성된 이동상 용액은 펌프에 의해 계속 일정한 속도로 HPLC 내부에 흐르게 되며 고정상으로 불리는 원통형 칼럼을 거쳐 검출기에 도달하고 최종적으로 폐액으로 배출됩니다. 이때 시료주입구에 혼합시료를 주입하면 이동상에 의해 혼합시료가 이동하고 고정상을 통과하게 되는데 혼합성분이 고정상 내부에 채워져 있는 충전재와 반응하여 각각 분리되어 검출기에서 검출되게 됩니다. 이렇게 분리되어 검출된 데이터는 크로마토그램으로 저장되는데 이러한 크로마토그램 데이터를 이용하여 각각의 성분에 대한 정성분석과 정량분석이 진행됩니다.

 

 

 

 

 

 

 

 

녹차에 있는 혼합성분중 카페인을 정성분석 하는 법

녹차 안에 든 혼합성분에서 카페인을 HPLC로 분리하는 과정을 예로 살펴보겠습니다.

먼저 녹차를 우리게 되면

1.Gallic acid (갈릭산)

2.Caffeine (카페인)

3.Epigallocatechin

4.Gallocatechin gallate

5.Epicatechin gallate

6.Gallocatechin

이러한 성분이 추출됩니다. 따라서 녹차우린물은 6가지 물질이 혼합된 혼합성분이라고 할 수 있습니다.

 

 

이러한 혼합성분이 든 혼합시료(녹차)가 HPLC장치에 주입되어 이동상에 의해 칼럼을 통과하면서 각각의 성분에 통과되어 피크로 나타나면 다음과 같은 크로마토그램을 얻을 수 있습니다.

 

그럼 여기 6개의 피크중 어떤 피크가 카페인을 나타내는 피크일까요?

 

위의 그림에서 보여주듯이 혼합시료가 주입된 시간부터 각 성분이 분리되어 검출기를 통과하고 피크가 만들어지는 시간까지를 보유시간(retention time)이라고 합니다. 지금 보이는 보유시간은 2번째 피크성분의 보유시간과 5번째 피크성분의 보유시간이며 이러한 보유시간은 분석조건이 일정한 경우 각 성분마다 전부 다른 특정한 값을 띄게 됩니다. 따라서 각 성분의 보유시간을 확인함으로써 그 피크가 어떤 성분인지 알아내는 것이 바로 HPLC를 이용한 정성분석입니다. 그럼 보유시간을 이용하여 카페인성분이 어떤 피크인지 알아내는 방법을 살펴보겠습니다.

 

 

 

 

 

 

이제 분석조건하에서 보유시간의 확인을 통해 혼합시료중 특정성분을 알아내는 과정을 설명할 것입니다. 일정한 분석조건이라는 것은 칼럼의 종류, 이동상액체의 조성, 이동상액체의 유속, 검출기의 종류가 변경되지 않고 동일한 상태로 분석하는 것을 말합니다.

 

위의 이미지 속 조건을 보면 칼럼은 일반적을 많이 사용하는 U-bondapak C18칼럼을 사용했으며 이동상은 MeOH과 물을 20 대 80의 비율로 섞었다는 것을 보여줍니다. 여기서 물은 일반증류수를 사용해서는 안되며 초순수를 의미합니다. 유속은 분당 1ML의 속도로 흘려보내주었으며, 검출기는 UV파장을 이용하여 280nm 파장에서 각 성분을 검출 했다는 것을 보여줍니다.

 

 

 

 

 

 

 

▶이같은 조건에서 혼합시료 중 카페인의 성분이 어떤 것인지 알고 싶다면 다음의 두가지 실험을 진행해야 합니다.

①먼저 순수한 카페인 단일성분만을 갖는 표준물질 시료를 HPLC에 주입해야합니다.(이 경우는 시료에 단일성분만 있기때문에 피크는 1개) 시료주입시간부터 피크가 나올때까지 걸린시간 즉, 보유시간을 확인해보니 15.9분 이었습니다.

 

 

 

 

②두번째로는 녹차를 우린시료 즉 6개의 혼합성분이 든 혼합시료를 주입합니다. 그러면 위의 그림에 나타난 대로 6개의 피크가 나타나게 됩니다. 이6개의 피크보유시간을 하나하나 살펴보니 5번째로 나타난 피크의 보유시간이 15.9분으로 카페인 표준물질의 보유시간과 동일함을 알 수 있습니다. 이러한 과정을 통해 위의 그림 6개의 성분 중 5번째의 혼합성분이 바로 카페인성분임을 알 수 있습니다.