절대검량선법 분석실험 과정 2 _ 표준액제조 및 검액제조

 

 

HPLC 정량분석을 위한 방법 중 절대검량선법을 이용한 분석과정 처음단계인 이동상용액을 제조 한 뒤 다음 순서인

• 표준액제조/검액제조에 대해 알아보겠습니다.

 

 

 

 

 

3.표준원액 및 표준액 제조

 

[표준원액제조]

두번째로 해야 할 일은 분석하고자하는 성분의 표준원액과 표준액의 제조 입니다.불순물이 포함되지않고 순수한 표준품을 이용하여 표준액을 제조하여야 합니다. 아래부터는 카페인 성분의 표준액을 제조하는 과정을 보여드리겠습니다.

 

 

1.     카페인 표준품을 준비합니다. Sigma Aldrich사에서 제조한 HPLC급의 고순도 표준품을 준비 (빨간뚜껑이 달린)

2.     카페인 표준품 100mg을 정밀하게 달아 100ml 용량플라스크에 투입합니다. 이화학실험을 할때는 표준액제조시 거의 증류수에 녹여 만들지만 HPLC의 시료는 반드시 이동상에 녹아야하며 표준액제조시에도 반드시 이동상용액에 녹여 만들어야 합니다

3.     이동상을 넣어 표선을 정확하게 맞춘다(이렇게 만든 용액을 표준원액 stock solution이라고합니다)

표준액을 쉽게 만들기 위해서 조금 농도가 높은 표준원액(stock solution)을 만들어야합니다. 여기서는 카페인 농도가 1000ppm이 되도록 표준원액을 만들었습니다. 카페인 표준품을 100mg 정밀하고 정확하게 칭량하여 100ml 용량플라스크에 투입하고 이동상용액을 넣어 정확히 표선하면 1000ppm용액이 됩니다.

 

 

 

*Tip*

농도는 비율입니다. 1000ppm은 1000mg이 1000ml에 녹아있는 비율이며, 다시말해 100mg이 100ml에 녹아있는비율=10mg이 10ml에 녹아있는비율=1mg이 1ml에 녹아있는비율을 의미합니다.

결국 이렇게 만든 표준원액을 1ml를 취하면 그안에는 카페인성분이 1mg 들어가 있다는 이야기입니다.

 

 

 

 

[표준액제조]

1.     조금전에 만든 1000ppm농도의 표준원액을 준비합니다

표준원액에 피펫으로 1ml를 취하면 그안에는 카페인이 1mg 들어가있습니다

2.     3개의 표준액을 만듭니다 각각 10/20/30ppm으로

 

10ppm은 10mg/L로 1mg/100ml의 비율이며, 20ppm은 2mg/100ml의 비율 그리고 30ppm은 3mg/100ml의 비율입니다. 따라서 표준액을 만들기위해서는 100ml의 표준원액에서 1ml,2ml,3ml를 각각 홀피펫으로 취하여 100ml 용량플라스크에 투입합니다 그리고 이동상으로 표선을 정확하게 맞추면 3개의 표준액이 만들어집니다.

3.     멤브레인 필터로 여과합니다

여과에 사용하는 멤브레인 필터의형태는 여러가지가 있는데 사진에 나타난 멤브레인 필터는 시린지에 연결하여 사용하므로 시린지필터라고합니다. 여과를 마친 시료는 바이알에 투입하여 분석을 진행하거나 혹은 마이크로시린지로 채취하여 분석을 진행 합니다.바이알에 투입하여 분석하는 경우는 자동시료 주입장치를 사용하는 경우이며, 마이크로시린지로 분석하는 경우는 수동시료 주입장치를 사용하는 경우입니다.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.검액의 제조

 

4.검액의 제조

게보린 혹은 펜잘 등에 의약품 내의 카페인 성분을 위해서는 시료용액을 제조해야합니다. 게보린정을 대상으로 분석 내용을 설명하겠습니다.

게보린정의 설명서를 살펴보면 게보린 한정내에 주성분인 아세트아미노펜과 이소프로필안티피린 그리고 카페인성분이 포함되어있는것을 알 수 있습니다. 그 중 카페인 성분이 한정당 50mg이 포함되어 있다고 표시되어 있습니다. 아래의 검액제조 순서에 따라 검액을 제조해 보겠습니다

 

(1) 의약품 20정의 질량을 정밀하게 질량(1정의 평균무게를 기록)

(2)20정을 막자사발로 곱게 간다

(3)1/2정에 해당하는 질량을 칭량한 후 100ml 용량플라스크에 투입한다

(4)이동상으로 표선까지 채워 섞는다

 

 

위의 과정을 더 자세히 설명해 보겠습니다

먼저 게보린 한정의 무게를 보다 정확하게 칭량하기 위해서 20정을 칭량하고 그 질량값을 20으로 나누어 1정의 평균무게를 기록합니다. 게보린 20정을 막자사발로 곱게갈아주고 그다음 평균 한정의 무게인 게보린정의 1/2만큼 칭량을 하고 100ml용량 플라스크에 투입합니다. 이동상용액으로 표선을 맞춰주면 이 용액에 포함된 카페인의 양은 25mg이 됩니다.

한정 안에 카페인이 50mg이 들어있는데 1/2정 만큼 들어간 상태이므로 카페인의 양은 25mg입니다. 물론 농도로 표시하면 25mg의 카페인이 100ml 플라스크안에 있으므로 25mg/100ml =250mg/1000ml 이니까 250ppm으로 표시할 수 있습니다. 편의상 이 용액을 A용액이라고 칭하겠습니다

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

그런데! 이 A용액을 그대로 분석에 사용하면 안됩니다!

게보린정을 만들기 위해서는 포장박스에 표시 된 성분은 물론이고 표시되지 않은 기타 부형제,접착제,윤활제 등의 첨가제가 들어갑니다. 따라서 이런 첨가제에 의해 검액이 많이 탁해집니다. 당연히 이런 성분을 제거하기위한 침전이나 여과과정을 거쳐야합니다. 과정은 아래와 같습니다

 

(5)방치하여 침전물을 가라앉힌다

(6)상징액 10ml를 정확하게 취하여 100ml 용량플라스크에 투입한다

(7)이동상으로 표선을 맞춘다

 

 

먼저 가만히 방치하여 침전물을 가라앉히고 정량분석 결과를 좋게 하기위해서 항상 시료의 농도가 표준액 농도의 사잇값이 되도록 제조하는 것이 좋습니다. 조금전 표준액 3가지의 농도를 10,20,30ppm으로 제조하였습니다. 따라서 시료의농도는 10ppm보다는 크고 30ppm보다는 작은값이 되도록 만드는것이 좋습니다. 현재 A용액의 농도는 250ppm입니다. 이농도를 25ppm정도로 희석하면 표준액 농도의 사잇값으로 적당합니다. 그럼 10배 희석해주는 과정이 필요하겠죠?

 

따라서 방치하여 침전시킨 후 맑은 상징액 10ml를 취하여 또다른 100ml 용량플라스크에 투입합니다. 그 후 이동상 용액으로 표선을 맞춰줍니다. 이렇게 희석하여 만든 용액이 검액시료가됩니다. 이 검액은 A용액을 10배 희석한 상태이므로 검액 내의 카페인농도는 25ppm이며 카페인 양으로 생각하면 2.5mg이 포함되어 있는 상태가 됩니다.마지막으로 이 용액을 멤브레인 필터로 여과해준 다음 시료주입장치의 종류에 따라 바이알에 투입하던지 마이크로시린지로 주입하면 됩니다.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

지금까지 이동상의 준비과정 표준액의 준비과정 및 시료액의 준비과정을 설명하였습니다

다음 포스팅에는 검량선을 작성하고 회귀직선을 구하는 분석방법에 대해 알려드리겠습니다